LAPORAN PRAKTIKUM

Diajukan guna memenuhi persyaratan acara praktikum Kimia Dasar pada laboratorium Biosain Politeknik Negeri Jember

Oleh :

Kelompok 01

                                    Nur Laila Sari              (A41170943)

                                    Muhammad Lutfi        (A41171133)

                                    Firdayatul Aulia          (A41171394)

                                    Ervina Qudsiah           (A41171065)

                                    Risqi putra wardani     (A41171307)

                                    M. Fariz Avin F.         (A41171394)

PROGRAM STUDI TEKNIK PRODUKSI BENIH

POLITEKNIK NEGERI JEMBER

2017

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. DNA ma nusia dapat diisolasi melalui darah. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi,contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp).

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.

Langkah pertama untuk mendapat- kan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang me- ngandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA.

1.2  Tujuan dan Manfaat

1.2.1        Tujuan

Tujuan dari dilaksanakannya kegiatan isolasi DNA genom pada daun tanaman cabai adalah :

a.       Untuk mengetahui tingkat kemurnian dan konsentrasi DNA genom yang di ekstrak dari daun tanaman cabai besar dan cabai kecil.

b.      Mampu membedakan hasil ekstraksi/isolasi DNA genom yang menggunakan Nitrogen cair dan tidak.

c.       Mampu menjelaskan hasil perhitungan dan perbandingan antara kemurnian dan konsentrasi dari steptofotometer dan hasil yang telah divisualisasi menggunakan UV trasluminator.

d.      Mampu mengidentifikasi DNA yang baik dan yang mengalami kerusakan (meroket).

1.2.2        Manfaat

Manfaat yang dapat diperoleh setelah praktikum isolasi DNA genom adalah sebagai berikut :

a.       Meningkatkan pengetahuan mahasiswa mengenai gen, genom, dan DNA.

b.      Memberikan pengalaman sebagai langkah awal untuk mampu mengembangkan tanaman secara in vitro.

c.       Mampu memberikan keberanian bagi mahasiswa untuk bersentuhan langsung dengan alat dan bahan kimia yang ada di laboratorium.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

            Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (yuwono,2008).

Salah satu prinsip isolasi DNA adalah dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan (Pazdernik nj. 2009).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90% keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus , maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (elrod, 2007).

            Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui DNA dari tanaman tersebut. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleus yang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

BAB 4. HASIL dan PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

                  berikut ini merupakan tabel hasil pengamatan kemurnian dan konsentrasi Dna Genom hasil isolasi dari daun tanaman cabai besar (Capsicum annum)  dan cabai kecil (Capsicum frustescent) dengan bantuan Steptofotometer :

No.	Golongan	Kelompok	Jenis tanaman	Kemurnian	Konsentrasi
1.	A	1	Cabai kecil	1,87	2,05
2.		2	Cabai kecil	2,14	2,78
3.		3	Cabai besar	2,29	1,28
4.		4	Cabai besar	2, 63	1,01
5.	B	1	Cabai besar	1,62	1,37
6.		2	Cabai besar	1,28	0,72
7.		3	Cabai kecil	1,98	0,16
8.		4	Cabai kecil	1,88	0,63
9.	C	1	Cabai besar	2,33	0,57
10.		2	Cabai besar	1,90	0,61
11.		3	Cabai kecil	1,95	1,32
12.		4	Cabai kecil	2,00	0,81
Rata – rata cabai besar				2,00	7,07
Rata-rata cabai kecil				1,97	0,92

Tabel 1.1: hasil uji kemurnian dan konsentrasi isolasi genom pada                            tanaman cabai besar dan kecil

Setelah diuji menggunakan steptofotometer, DNA di masukkan pada alat Elektrofotoresis dengan media gel agarus dan dipanaskan selama selama 30 menit dengan tekanan 100 Volt (proses running). Setelah 30 menit, cetakan media gel agaros yang telah terisi hasil per running an DNA, dimasukkan ke dalam UV transluminator untuk di visualisasi, maka nampaklah pergerakan  dari DNA hasil seperti gambar di bawah ini :

 

Doc. Kelompok B1. Uv.transluminator, lab.biosains

Gambar 1.1  hasil isolasi DNA genom setelah di visualisaasi menggunakan UV trasfometer.

4.2 Pembahasan

Genom merupakan sepotong DNA/segment DNA yang menyandi protein mengandung semua informasi genetic yang dimilikinya. Dengan penemuan ini ditemukan bagaimana informasi genetic diwariskan dan diekspresikan. Sedangkan DNA adalah asam nukleat yang mengandung perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara selular. DNA sendiri terdapat pada nucleus, kloroplas dan mitokondria.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kegiatan isolasi DNA adalah pertama, keutuhan molekul DNA, idelanya semakin besar molekul DNA yang dapat diisolasi akan semakin baik. Kedua, efektifitas isolasi, pada jaringan tanaman tertentu kemungkinan memiliki lapisan dinding sel yang terdiri dari senyawa selulosa, atau pectin yang lebih tebal dibandingkan dengan yang lain. Ketiga,  kemurnian DNA hasil isolasi, seringkali bahwa SNA yang diisolasi masil mengandung senyawa-senyawa protein pada jumlah tertentu, ataupun senyawa metabolic seunder lainnya yang dapat menghambat efektifitas pencernaan secara enzimatis. Oleh sebab itu, tindakan pengontrolan kualitas DNA dengan melakukan pemisahan secara elektroforesis segera setelah tahap isolasi dilakukan mutlak untuk dilaksanakan agar kualitas DNA yang dihasilkan dapat diketahui secara dini. Keempat, praktis dan ekonomis, metode isolasi yang ideal tentu saja adalah metode yang memiliki prosedur langkah kerja yang sederhana, cpat dan membuat biaya yang murah.  

Sebelum memasuki proses selanjutnya, kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi perlu dihitung menggunakan steptofotometer. Tingkat kemurnia dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai 260  nm – 280 nm pada sampel DNA. Nilai 260 nm merupakan nilai maksimum DNA dapat menyerap cahaya, nilai tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan kkonsentrasi DNA, sedangkan nilai 280 nm merupakan nilai maksimum residu protein dapat menyerap cahaya. Seperti yang sudah ditampilkan pada tabel 1.1 di atas yang merupakan hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi menggunakan alat spektofotometer yang dapat disimpulkan bahwa rata-rata dari konsentrasi dan kemurnian isolasi DNA genom daun cabai besar (Capsucum annum) secara berturut turut adalah 7,70 dan 2,00, sedangkan untuk cabai kecil konsentrasi dan kemurnian secara berturut turut adalah 0,92 dan 1,97. Sehingga apabila dilihat dari rata-rata kemurniannya, hasil isolasi DNA genom ini layak untuk menuju tahapan uji selanjunya.

 Analisa DNA dimulai dengan melakukan ekstraksi/isolasi DNA genom dari salah satu bagian tumbuhan yang mengandung banyak DNA, seperti daun. Ekstraksi DNA dimulai dengan pengekstrakan daun muda tanaman cabai besar (Capsicum annum) yang mengandung sedikit komponen selain DNA , Presipitasi, purifikasi, elektroforesis dan terakhir visualisasi oelh UV transluminator. Kualitas DNA hasil ekstraksi dianalisis dengan bantuan gel agaros yang diektrak dari tanaman rumput laut , yang digunakan untuk melihat mobilitas/pergerakan DNA melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang ukurannya kecil akan lebih cepat bermigrasi karena memiliki esekan yang relative rendah saat bergerak mnuju elektroda positif.  Kemudian hasil pergerakan DNA dari elektroforesis divisualisasi dengan UV transluminator, seperti pada gambar 1.1.

Dari gambar hasil visualisasi UV trasluminator dapat diketahui bahwa pita DNA terlihat menyebar seperti yang ditujukan pada gambar golongan B, menunjukkan adanya ikatan antar molekul DNA yang terputus yang diduga terjadi saat proses ekstraksi berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi bagian yang lebih kecil (dalam ilmu biokimia disebut dengan istilah meroket). Terputusnya ikatan antar molekul tersebut dapat disebabkan oleh adanya gesekan fisik yang berlebihan pada proses pemipetan, pada saat proses pengocokan dibolak balik, disentrifus, atau dikarena tidak digunaknnya nitrogen cair saat proses ekstraksi oleh golongan B.  Penggunaan Nitrogen cair akan sangat berpengaruh pada tingkat kemurnian genom, karena fungsi dari nitrogen cair adalah untuk mempermudah pemisahan komponen lain selaun DNA, sehingga akan didapatkan DNA murni. Proses pengekstraksian pada golongan B dikatakan masih belum sempurna sehingga masih banyak komponen lain selain DNA yang masih tercampur.

Dari hasil isolasi DNA di atas, terlihat pada A2 dan C1 muncul lokus- lokus gen yang menunjukkan adanya pergerakan DNA yang dapat dilihat setelah divisualisasi dengan UV transluminator. Bagian ini dapat dikatakan baik di antara hasil kelompok yang lain, namun bukan berarti pengisolasian yag dilakukan kelompok lain menunjukkan kegagalan, karena setiap praktikum dan penelitian pasti membutuhkan evaluasi dari praktikum sebelumnya.

Banyak sedikitnya DNA yang dihasilkan dipengaruhi oleh beberapa faktor pada saat ekstraksi dan kondisi sample. Komalasari (2009) menyatakan bahwa konsentrasi hasil DNA dipengaruhi oleh dua faktor yaitu kecepatan ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis buffer. Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor yang paling berpengaruh karena pada tahap lisis sel dan presipitasi.

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

       Dari praktikum isolasi DNA genom dari daun tanaman cabai besar dan cabai kecil, maka dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut :

a.       Untuk dapat mengetahui tingkat kemurnian dan konsentrasi suatu DNA genom, maka perlu dilakukannya isolasi dan harus melewati beberapa proses yang telah ditetapkan.

b.      Setelah DNA genom di visualisasi oleh UV Transluminator, maka praktikan mampu membedakan mana hasil DNA genom yang memenuhi standart untuk pengujian lanjut, dan mana hasil yang kurang sempurna, serta penyebabnya.

c.       Praktikan telah mampu membedakan hasil perhitungan kemurnian dan konsentrasi oleh steptofotometer dengan hasil visualisasi UV trasnluminator, serta praktikan mampu untuk menghitung secara manual.

5.2 Saran

       Berikut ini merupakan beberapa saran yang ditujukan kepada praktikan maupun teknisi labolatorium adalah sebagai berikut :

a.       Dalam setiap melakukan praktikum, akan lebih baik apabila praktikan mengenakan pakaian jas dan alat perindungan diri lainnya, karena selama proses praktikum akan selalu berhubungan dan berdekatan dengan alat dan bahan bahan kimia yang tentunya mmiliki dampak negative bagi kesehatan.

b.      Dalam proses praktikum, akan lebih baik apabila praktikan mampu melakukan kegiatan isolasi sesuai yang telah diintruksikan sebelumnya oleh teknisi laboratoriium, sehingga praktikan mampu lebih banyak berperan di dalamnya.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana Dwi Wahyuni. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom menggunakan    modifikasi Buffer CTAB. Sumatra Barat : BPTB

Ferdiah, Pujiyanto. 2013. Optimasi Isolasi DNA cabai berdasarkan kualitas dan    kuatitas daun serta teknik penggerusan. Semarang : Universitas   Diponegoro

Husada Eko Darma, dkk. 2014. Laporan Akhir Praktikum Pengantar Bioteknologi Pertanian. Padang : Universitas Andalas